實時熒光定量 PCR 技術(shù)的分類：熒光探針法：水解探針法。水解探針的結(jié)構(gòu)特點是寡核苷酸序列

的 5′端為熒光報告基團，3′端 為 熒 光 淬 滅 基 團。PCR 擴 增

前，探針游離于靶序列外，報告基團發(fā)出的熒光被淬滅基團

吸收，檢測不到熒光，但有時會因淬滅不徹底，會檢測到微

弱的熒光。在 PCR 退火時，探針特異性地結(jié)合到靶序列上，

在延伸階段，利用 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性將探針?biāo)猓?

熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，熒光信號被釋放，并與

PCR 產(chǎn)物的數(shù)量成正相關(guān)。由于水解探針的作用機理依賴

于 Taq 酶 5′-3′外切酶的活性，所以水解探針又稱為 Taqman

探針。 上海融享生物科技有限公司的qPCR種類繁多。寧夏SYBR熒光染料qPCR機構(gòu)電話

復(fù)合探針 復(fù)合探針(complex probes)法的 基本原理綜合了 LightCy cler 和分子信標(biāo) 2 種技術(shù) 的優(yōu)點 ,還克服了他們的不足。首先合成 2 個探針, 一是熒光探針(25 bp), 5' 端接一熒光分子 ,另一為 淬滅探針(15 bp), 3' 端接一淬滅分子 , 淬滅探針能 與熒光探針 5' 端雜交 。當(dāng)溶液中沒有模板時, 2 種 探針特異結(jié)合,熒光探針發(fā)出的熒光被淬滅探針吸 收 ,溶液中沒有熒光產(chǎn)生;當(dāng)溶液中有模板時 ,在較 高溫度下熒光探針優(yōu)先與模板結(jié)合, 從而使兩探針 分離 ,產(chǎn)生熒光。熒光強度與溶液中模板數(shù)量成正 比 ,因此可進(jìn)行 PCR 定量。其優(yōu)點為:①使用非熒 光淬滅劑,本底低 ;②對擴增效率影響小 ;③探針設(shè) 計 、合成 、標(biāo)記、純化方便。云南TaqMan探針法qPCR哪家好qPCR的項目有很多種。

法也稱作標(biāo)準(zhǔn)曲線法，是一種利用已知的標(biāo)

準(zhǔn)曲線來定量未知樣本目的模板起始量的方法。以 5 點梯

度稀釋所得的標(biāo)準(zhǔn)品為模板，經(jīng)實時熒光定量 PCR 擴增，以

目的模板初始拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標(biāo)，檢測到的 CT 值為縱

坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程，將未知樣本的 CT

值帶入該方程即可計算出目的模板的起始量。標(biāo)準(zhǔn)曲線的各

項指標(biāo)：斜率、擴增效率（E）、相關(guān)系數(shù)（R2

）、間距均需進(jìn)行

嚴(yán)格評價，從而確保該曲線的可用性。

在 PCR 反應(yīng)體系中，加入過量的 SYBR Green Ⅰ熒光 染料，使其特異地與 dsDNA 分子結(jié)合后，發(fā)射熒光信 號，熒光強度隨著聚合反應(yīng)的進(jìn)行逐漸增加; 因此，可 被熒光探測系統(tǒng)檢測到，熒光強度的增加與初始模板 量相關(guān)，可以進(jìn)行定量 DNA 分析。熒光染料的優(yōu)勢 在于它能監(jiān)測任何 dsDNA 序列的擴增，不需要探針 的設(shè)計，檢測方法簡便，降低了檢測成本。然而，由于 熒光染料能與任何 dsDNA 分子結(jié)合，也能與非特異

性的 dsDNA 分子( 如引物二聚體) 結(jié)合，產(chǎn)生熒光干 擾，使試驗產(chǎn)生假陽性結(jié)果。目前，可以用帶有熔解 曲線分析的軟件解決這個問題。 qPCR項目找上海融享生物科技有限公司。

在采用 SYBR Green I 法進(jìn)行相對定量時，需要 利用熔解曲線排除非特異產(chǎn)物或引物二聚體對測定結(jié) 果的影響。有研究建議在每一個循環(huán)中 PCR 延伸后 增加一步，即將溫度提高后再檢測反應(yīng)體系中的熒 光［15］。該檢測溫度大于引物二聚體的退火溫度 Tm， 而小于特異性擴增產(chǎn)物的 Tm 值。在此溫度下，引物 二聚體都變性成單鏈，因此只檢測到與特異性 PCR 產(chǎn) 物結(jié)合的 SYBR Green I 所發(fā)出的熒光，消除了引物 二聚體的干擾，降低了非特異性熒光，有助于目標(biāo)基因 的準(zhǔn)確定量。

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RT-qPCR 的 Ct 值偏大主要有兩種情況，一種是所有基因 Ct 都偏大，另外一種是個別基因 Ct 偏大。寧夏SYBR熒光染料qPCR機構(gòu)電話

雙雜交探針技術(shù)是 Roche 公司開發(fā)的一種 PCR 定量技術(shù)，使用 2 個雜交探針，能提高特異性。該

技術(shù)是將 2 條探針中的 1 條在 5'端標(biāo)記熒光，1 條在 3'端標(biāo)記熒光，其中一個為受體熒光基團，另一個為 供體熒光基團，2 個探針可與模板同 1 條鏈相鄰的序 列雜交。在自由狀態(tài)時，供體熒光基團的發(fā)射光譜覆 蓋受體熒光基團的激發(fā)光譜; 因此，只能檢測到供體 熒光基團發(fā)出的熒光。在 PCR 退火階段中 2 條探針 與目的基因特異性結(jié)合，首尾連接，使供體和受體熒 光距離非常接近，兩者產(chǎn)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，使受 體熒光基團發(fā)出熒光。由于熒光共振能量轉(zhuǎn)移探針 是靠近發(fā)光，所以檢測信號是實時信號，而非累積信 號。該方法的特點是淬滅效率高，但由于2 個探針 結(jié)合于模板上; 因此，會影響擴增效率，而且需要合成 2 個較長的探針，合成成本相對較高。 寧夏SYBR熒光染料qPCR機構(gòu)電話