熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490--495nm，較大發(fā)射光波長520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結構式如下：有兩種同分異結構，其中異構體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點是：①人眼對黃綠色較為敏感，②通常切片標本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長期保存。結構式如下：較大吸收光波長為570nm，較大發(fā)射光波長為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結構式如下：較大吸引光波長為550nm，較大發(fā)射光波長為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對比鮮明，可配合用于雙重標記或?qū)Ρ热旧?。其異硫氰基可與蛋白質(zhì)結合，但熒光效率較低。免疫熒光技術可以用于研究細胞信號傳導和信號通路。CD68免疫熒光

其他熒光物質(zhì)：酶作用后產(chǎn)生熒光的物質(zhì)某些化合物本身無熒光效應，一旦經(jīng)酶作用便形成具有強熒光的物質(zhì)。例如4-甲基傘酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作用分解成4-甲基傘酮，后者可發(fā)出熒光，激發(fā)光波長為360nm，發(fā)射光波長為450nm。其他如堿性酸酶的底物4-甲基傘酮磷酸鹽和辣根過氧化物酶的底物對羥基乙酸等。鑭系螯合物某些3價稀土鑭系元素如銪（Eu3）、鋱（Tb3）、鈰（Ce3）等的螯合物經(jīng)激發(fā)后也可發(fā)射特征性的熒光，其中以Eu3應用較廣。Eu3螯合物的激發(fā)光波長范圍寬，發(fā)射光波長范圍窄，熒光衰變時間長，較適合用于分辨熒光免疫測定。CD20免疫熒光免疫熒光技術可以用于研究細胞內(nèi)分子的相互作用。

免疫熒光技術又稱熒光抗體技術，是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種。它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。很早以來就有一些學者試圖將抗體分子與一些示蹤物質(zhì)結合，利用抗原抗體反應進行組織或細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的定位。免疫熒光技術是標記免疫技術中發(fā)展較早的一種．它是在免疫學、生物化學和顯微鏡技術的基礎上建立起來的一項技術。Coons等于1941年初次采用熒光素進行標記抗體獲得成功。經(jīng)過幾十年的發(fā)展，該技術已相當成熟。用熒光抗體示蹤或檢查相應抗原的方法稱熒光抗體法；用已知的熒光抗原標記物示蹤或檢查相應抗體的方法稱熒光抗原法。這兩種方法總稱免疫熒光技術。在實際工作中熒光抗原技術很少應用，所以人們習慣將熒光抗體技術稱為免疫熒光技術

免疫熒光通過抗體與示蹤物質(zhì)結合，利用抗原-抗體結合反應，進而對抗原所在的細胞或組織進行定性或定量。由于熒光素所發(fā)的熒光可在熒光顯微鏡下檢出，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光，可以看見熒光所在的細胞或組織，利用定量技術測定含量，從而可對抗原進行細胞定性和定位分析。細胞免疫熒光用途：快速直觀顯示所檢測蛋白的細胞定位。材料與儀器：樣品：貼壁細胞；試劑：4% 組織固定液，PBS，Triton X-100，BSA，熒光二抗，免疫熒光染色二抗稀釋液，抗熒光猝滅封片液，0.25% 胰酶；器材：6/12/24 孔板，細胞爬片（蓋玻片），載玻片，15 ml 離心管。免疫熒光技術可以用于研究細胞凋亡、細胞增殖和細胞分化等生物學過程。

免疫熒光應用范圍：其應用范圍極其普遍，可以測定內(nèi)分泌、蛋白質(zhì)、多肽、核酸、神經(jīng)遞質(zhì)、受體、細胞因子、細胞表面抗原、肉瘤標志物、血藥濃度等各種生物活性物質(zhì)。根據(jù)診斷類別，又可分為傳染性疾病、內(nèi)分泌、藥物檢測、免疫學、血型鑒定等。許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長為490495nm，較大發(fā)射光波長520530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光。熒光抗體技術可用于檢測和定位各種抗原，也可以用于檢測和定位抗體。COX2免疫熒光檢查

免疫熒光技術可以用于研究食品安全和生物安全。CD68免疫熒光

細胞免疫熒光實驗注意事項：1、建議細胞直接種孔板，采用倒置熒光顯微鏡拍照，這樣可以避免然后挑片時造成劃片或細胞片破損以及然后封片可能造成滑片等結果；2、若實驗室只有正置熒光顯微鏡，則需要將細胞植于細胞爬片。建議直接購買處理過的細胞爬片；若只有普通細胞爬片，可以先將爬片于濃酸（濃酸腐蝕性強，注意操作）或 75% 乙醇浸泡過夜，若用酸浸泡過夜，第二天先用自來水小心沖洗掉爬片殘留的酸液，若用 75% 乙醇浸泡，則不需要此步驟。然后，用洗潔精搓洗爬片，然后用去離子水清洗爬片。置于烘箱 80 ℃ 烘干，再將爬片置于超凈臺造紫外消毒后備用。CD68免疫熒光