細(xì)胞爬片的免疫熒光步驟基本一致：1. 取出細(xì)胞爬片放到35mm或60mm用過的細(xì)胞培養(yǎng)皿里，PBS洗三遍。注意：有的時(shí)候作的細(xì)胞爬片可能比較小，因此夾取的時(shí)候要小心，注意 反正面，放在皿里洗比較方便，避免了來回夾取，另外洗的時(shí)候加PBS不要太沖，不要細(xì)胞沖下來。洗的時(shí)候我都是多加PBS，稍晃一下就倒掉，沒有等5分鐘或10分鐘。2. 4%冷的多聚甲醛固定20分鐘，PBS洗三遍。3. 0.2%Triton X-100通透10分鐘，PBS洗三遍。4. 與二抗相同宿主的血清封閉30分鐘，PBS洗三遍。5. 一抗4度濕盒內(nèi)過夜，也可37度2小時(shí)，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6. 二抗室溫2小時(shí)(避光)，或者37度1半小時(shí)，PBS洗三遍。7. 較好用DAPI染核，然后直接照熒光片。8. 蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周，因?yàn)楦视筒幌髽渲菢訒?huì)干，所以不用指甲油封的話會(huì)弄的一塌糊涂。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)技術(shù)用于顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的抗原或半抗原物質(zhì)。COL-2免疫組化IHC

直接免疫熒光：?jiǎn)慰贵w（一抗）用于免疫染色和檢測(cè)目標(biāo)蛋白。熒光素結(jié)合的一抗直接與目標(biāo)抗原結(jié)合，并使用成像顯微鏡觀察。直接免疫熒光的優(yōu)點(diǎn)：由于無需為兩種抗體選擇不同的物種反應(yīng)性，從而降低了物種交叉反應(yīng)性問題。與間接免疫熒光相比，時(shí)間縮短（操作步驟減少）。直接免疫熒光的缺點(diǎn)：不允許通過二抗進(jìn)行信號(hào)放大；檢測(cè)靈敏度降低；熒光素結(jié)合一抗的選擇有限；與使用熒光二抗的檢測(cè)相比，更昂貴。間接免疫熒光：使用兩種抗體（一抗和二抗）進(jìn)行免疫染色并檢測(cè)目標(biāo)蛋白。首先，用特異性一抗標(biāo)記目標(biāo)蛋白。然后，熒光素結(jié)合的二抗（與一抗具有不同的物種反應(yīng)性）識(shí)別結(jié)合的抗原-抗體復(fù)合物并與一抗結(jié)合。由于一個(gè)以上的二抗可以與一抗結(jié)合，熒光信號(hào)被放大，提供了更高的檢測(cè)靈敏度。osteocalcin(ocn)免疫組化免疫熒光技術(shù)可以用于研究細(xì)胞遷移和細(xì)胞黏附。

免疫熒光間接法：如檢查未知抗原，先用已知未標(biāo)記的特異抗體（一抗體）與抗原標(biāo)本進(jìn)行反應(yīng)，用水洗去未反應(yīng)的抗體，再用標(biāo)記的抗抗體（第二抗體）與抗原標(biāo)本反應(yīng)，使之形成抗體—抗原—抗體復(fù)合物，再用水洗去未反應(yīng)的標(biāo)記抗體，干燥、封片后鏡檢。如果檢查未知抗體，則表明抗原標(biāo)本是已知的，待檢血清為一抗體，其它步驟的抗原檢查相同。標(biāo)記的抗抗體是抗球蛋白抗體，同于血清球蛋白有種的特異性，如免疫抗雞血清球蛋白只對(duì)雞的球蛋白發(fā)生反應(yīng)，因此，制備標(biāo)記抗體適用于任何抗原的診斷。

熒光物質(zhì)，熒光色素：許多物質(zhì)都可產(chǎn)生熒光現(xiàn)象，但并非都可用作熒光色素。只有那些能產(chǎn)生明顯的熒光并能作為染料使用的有機(jī)化合物才能稱為免疫熒光色素或熒光染料。常用的熒光色素有：⑴異硫氰酸熒光素為黃色或橙黃色結(jié)晶粉末，易溶于水或酒精等溶劑。分子量為389.4，較大吸收光波長(zhǎng)為490--495nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)520--530nm，呈現(xiàn)明亮的黃綠色熒光，結(jié)構(gòu)式如下：有兩種同分異結(jié)構(gòu)，其中異構(gòu)體Ⅰ型在效率、穩(wěn)定性、與蛋白質(zhì)結(jié)合能力等方面都更好，在冷暗干燥處可保存多年，是應(yīng)用較普遍的熒光素。其主要優(yōu)點(diǎn)是：①人眼對(duì)黃綠色較為敏感，②通常切片標(biāo)本中的綠色熒光少于紅色。⑵四乙基羅丹明為橘紅色粉末，不溶于水，易溶于酒精。性質(zhì)穩(wěn)定，可長(zhǎng)期保存。結(jié)構(gòu)式如下：較大吸收光波長(zhǎng)為570nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為595～600nm，呈橘紅色熒光。⑶四甲基異硫氰酸羅丹明結(jié)構(gòu)式如下：較大吸引光波長(zhǎng)為550nm，較大發(fā)射光波長(zhǎng)為620nm，呈橙紅色熒光。與FITC的翠綠色熒光對(duì)比鮮明，可配合用于雙重標(biāo)記或?qū)Ρ热旧Ｆ洚惲蚯杌膳c蛋白質(zhì)結(jié)合，但熒光效率較低。早期的免疫熒光技術(shù)是將抗體與示蹤物質(zhì)結(jié)合，用于定位組織或細(xì)胞內(nèi)的抗原物質(zhì)。

免疫熒光技術(shù)的主要特點(diǎn)是：特異性強(qiáng)、敏感性高、速度快。主要缺點(diǎn)是：非特異性染色問題尚未完全解決，結(jié)果判定的客觀性不足，技術(shù)程序也還比較復(fù)雜。熒光免疫法按反應(yīng)體系及定量方法不同，還可進(jìn)一步分做若干種。與放射免疫法相比，熒光免疫法無放射性污染，并且大多操作簡(jiǎn)便，便于推廣。國(guó)外生產(chǎn)的TDM用試劑盒，有相當(dāng)一部分即屬于此類，并且還有TDM熒光偏振免疫分析用的自動(dòng)分析儀生產(chǎn)。由于一般熒光測(cè)定中的本底較高等問題，熒光免疫技術(shù)用于定量測(cè)定有一定困難。新發(fā)展了幾種特殊的熒光免疫測(cè)定，與酶免疫測(cè)定和放射免疫分析一樣，在臨床檢驗(yàn)中應(yīng)用。免疫熒光技術(shù)可以用于研究心血管系統(tǒng)的疾病和醫(yī)治。osteocalcin(ocn)免疫組化

免疫熒光技術(shù)可以同時(shí)檢測(cè)多個(gè)目標(biāo)分子，通過不同顏色的熒光染料進(jìn)行標(biāo)記。COL-2免疫組化IHC

熒光效率：熒光分子不會(huì)將全部吸收的光能都轉(zhuǎn)變成熒光，總或多或少地以其他形式釋放。熒光效率是指熒光分子將吸收的光能轉(zhuǎn)變成熒光的百分率，與發(fā)射熒光光量子的數(shù)值成正比。熒光效率＝發(fā)射熒光的光量分子數(shù)（熒光強(qiáng)度）／吸收光的光量子數(shù)（激發(fā)光強(qiáng)度）。發(fā)射熒光的光量子數(shù)亦即熒光強(qiáng)度，除受激發(fā)光強(qiáng)度影響外，也與激發(fā)光的波長(zhǎng)有關(guān)。各個(gè)熒光分子有其特定的吸收光譜和發(fā)射光譜（熒光光譜），即在某一特定波長(zhǎng)處有較大吸收峰和較大發(fā)射峰。選擇激發(fā)光波長(zhǎng)量接近于熒光分子的較大吸收峰波長(zhǎng)，且測(cè)定光波量接近于較大發(fā)射光波峰時(shí)，得到的熒光強(qiáng)度也較大。COL-2免疫組化IHC