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溫州Co IP免疫沉淀實驗原理

來源: 發(fā)布時間:2024-06-25

免疫共沉淀分析(Co-IP)實驗原理與IP十分類似,基本的技術(shù)都是采用目標抗原特異性的固相化抗體;但IP的目標是純化單一抗原,而Co-IP旨在分離抗原及與抗原結(jié)合的蛋白質(zhì)或配體。

在Co-IP實驗中,已知抗原稱為誘餌蛋白,與之結(jié)合的蛋白則稱為靶蛋白。靶蛋白可能是一些復雜的伴侶蛋白、信號分子、結(jié)構(gòu)蛋白、輔助因子等,蛋白間相互作用強度范圍可能介于高度瞬時和十分穩(wěn)定之間。基本的Co-IP實驗方案與IP相同,實際上任何IP系統(tǒng)均可用于Co-IP。但是,還有許多其他因素需要考慮,例如,結(jié)合和洗滌條件的優(yōu)化,優(yōu)化時,需要考慮到誘餌蛋白-靶蛋白的相互作用強度以及抗體-誘餌蛋白的親和力。
免疫沉淀IP技術(shù)選瓊脂糖珠還是磁珠?溫州Co IP免疫沉淀實驗原理

RIP 技術(shù)的原理(RNA Binding Protein Immunoprecipitation Assay,RNA 結(jié)合蛋白免疫沉淀)主要是運用針對目標蛋白的抗體把相應(yīng)的RNA-蛋白復合物沉淀下來,經(jīng)過分離純化就可以對結(jié)合在復合物上的RNA 進行q-PCR驗證或者測序分析。

RIP 是研究細胞內(nèi)RNA 與蛋白結(jié)合情況的技術(shù),是了解轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)動態(tài)過程的有力工具。RIP可以看成是普遍使用的染色質(zhì)免疫沉淀ChIP技術(shù)的類似應(yīng)用,但由于研究對象是RNA-蛋白復合物而不是DNA-蛋白復合物,RIP實驗的優(yōu)化條件與ChIP實驗不太相同,如:RIP反應(yīng)體系中的試劑和抗體不能含有RNA酶,抗體需經(jīng)RIP實驗驗證等等。
廣州Protein AG免疫沉淀磁珠貨期免疫沉淀技術(shù)RIP的原理是什么?

RIP技術(shù)的優(yōu)勢在于:
1. 特異性:利用特異性抗體,可以精確地捕獲目標RNA結(jié)合蛋白及其相互作用的RNA。
2. 應(yīng)用場景多:適用于研究RNA結(jié)合蛋白、miRNA、lncRNA等非編碼RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。
3. 技術(shù)結(jié)合:RIP后的RNA可以用于多種下游分析,如qPCR、測序等,為研究RNA的功能和調(diào)控提供了重要信息。
RIP技術(shù)的限制包括:
1. 抗體質(zhì)量:需要高質(zhì)量的特異性抗體,否則可能得到假陽性或假陰性結(jié)果。
2. 非特異性結(jié)合:可能存在非特異性結(jié)合問題,需要仔細的實驗設(shè)計和對照來控制。

免疫沉淀IP實驗中磁珠還是瓊脂糖珠的選擇取決于客戶實驗情況。
瓊脂糖珠海綿狀的結(jié)構(gòu)  (直徑 50-150 μm)  可以結(jié)合抗體  (繼而結(jié)合靶蛋白) ,它能夠直接高效、快速結(jié)合抗體,而不需借助特殊的專業(yè)設(shè)備。瓊脂糖珠呈多孔結(jié)構(gòu),這使得它們擁有更大的表面積可與蛋白質(zhì)相互接觸,具有更高的結(jié)合載量。
與瓊脂糖珠不同,磁珠是固體,抗體的結(jié)合限于磁珠的表面。磁珠 (直徑 1-4 μm) 明顯小于瓊脂糖珠 ,盡管磁珠沒有多孔中心增加結(jié)合能力,但每體積的磁珠數(shù)量比瓊脂糖珠多,使磁珠擁有足夠的抗體結(jié)合表面積滿足高容量的抗體結(jié)合。
簡而言之,瓊脂糖珠的結(jié)合能力較強,而磁珠在得率,可重復性以及自動化方面有明顯的優(yōu)勢。
免疫沉淀純化所得抗原量低是什么原因?

免疫沉淀純化所得抗原量低有多種原因,
A. 純化所得抗原量低
1. 抗原結(jié)合水平低
IP 應(yīng)用中出現(xiàn)低抗原結(jié)合水平的可能原因有很多,結(jié)合反應(yīng)所使用的溶液是重要原因之一。必須使用適合的緩沖液,有特定的pH和鹽濃度,可能還需要添加互作所需的輔助因子。IP 或Co-IP 中用于純化的抗體是影響得率的另一個重要因素。如果抗體本身易失活或與抗原結(jié)合微弱,則可能很難找到足夠溫和的條件,即能產(chǎn)生結(jié)合,又能保證在孵育和洗滌過程中結(jié)合可以穩(wěn)定保持。
2. 抗原洗脫水平低
在某些情況下,抗原與抗體或結(jié)合蛋白結(jié)合之間可能會發(fā)生極強的相互作用,傳統(tǒng)的洗脫緩沖液無法將其破壞。如果需要使用溫和洗脫緩沖液收集功能性抗原,則上述矛盾尤為突出。

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免疫沉淀技術(shù)是什么?溫州Co IP免疫沉淀實驗原理

免疫沉淀(Co-IP)實驗中抗體的選擇非常關(guān)鍵,因為抗體的特異性和親和力直接影響到實驗的成功與否。
1. 特異性:抗體應(yīng)當對目標蛋白具有高度的特異性,以避免與其他蛋白發(fā)生非特異性結(jié)合,導致假陽性結(jié)果。
2. 親和力:抗體對目標蛋白的親和力要足夠高,以確保在免疫沉淀過程中能夠有效地捕獲目標蛋白。
3. 抗體類型:單克隆抗體和多克隆抗體都可以用于IP實驗。單克隆抗體提供更高的特異性和批間一致性,而多克隆抗體可能提供更強的結(jié)合能力和更廣的表位覆蓋。
4. 應(yīng)用驗證:選擇已經(jīng)過免疫沉淀(Co-IP)或相關(guān)應(yīng)用(如Western blot, IHC)驗證的抗體,這增加了實驗成功的可能性。
5. 供應(yīng)商信息:選擇信譽良好的抗體供應(yīng)商,并查看供應(yīng)商提供的技術(shù)數(shù)據(jù)和客戶評價,以幫助做出決策。
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