對于雙光子成像而言，離焦和近表面熒光激發(fā)是兩個比較大的深度限制因素，而對于三光子成像這兩個問題大大減小，但是三光子成像由于熒光團的吸收截面比2P要小得多，所以需要更高數(shù)量級的脈沖能量才能獲得與2P激發(fā)的相同強度的熒光信號。功能性3P顯微鏡比結構性3P顯微鏡的要求更高，它需要更快速的掃描，以便及時采樣神經(jīng)元活動；需要更高的脈沖能量，以便在每個像素停留時間內收集足夠的信號。復雜的行為通常涉及到大型的大腦神經(jīng)網(wǎng)絡，該網(wǎng)絡既具有局部的連接又具有遠程的連接。要想將神經(jīng)元活動與行為聯(lián)系起來，需要同時監(jiān)控非常龐大且分布普遍的神經(jīng)元的活動，大腦中的神經(jīng)網(wǎng)絡會在幾十毫秒內處理傳入的刺激，要想了解這種快速的神經(jīng)元動力學，就需要MPM具備對神經(jīng)元進行快速成像的能力?？焖費PM方法可分為單束掃描技術和多束掃描技術。光子顯微成像技術不是什么新技術，早在20多年前就有了，目前已經(jīng)在生命科學和材料科學中廣泛應用。美國離體多光子顯微鏡實驗操作

單束掃描技術可以高速遍歷大視場（FOV）的神經(jīng)組織：使用MPM對神經(jīng)元進行成像時，通過隨機訪問掃描—即激光束在整個視場上的任意選定點上進行快速掃描—可以只掃描感興趣的神經(jīng)元，這樣不僅避免掃描到任何未標記的神經(jīng)纖維，還可以優(yōu)化激光束的掃描時間。隨機訪問掃描（圖1）可以通過聲光偏轉器（AOD）來實現(xiàn)，其原理是將具有一個射頻信號的壓電傳感器粘在合適的晶體上，所產(chǎn)生的聲波引起周期性的折射率光柵，激光束通過光柵時發(fā)生衍射。通過射頻電信號調控聲波的強度和頻率從而可以改變衍射光的強度和方向，這樣使用1個AOD就可以實現(xiàn)一維橫向的任意點掃描，利用1對AOD，結合其他軸向掃描技術可實現(xiàn)3D的隨機訪問掃描。但是該技術對樣本的運動很敏感，易出現(xiàn)運動偽影。目前，快速光柵掃描即在FOV中進行逐行掃描，由于利用算法可以輕松解決運動偽影而被普遍的使用。美國嚙齒類多光子顯微鏡三維分辨率多光子顯微鏡技術的優(yōu)勢如何？又有哪些應用？

當激光光束焦點的位置在鏡面上，此時被反射的激光在無限空間中成為準直光束，并在OBJ2的焦平面上形成了一個激光光斑。同理，如果橫向掃描光束，則會形成遠離傾斜鏡鏡面的焦點，這又導致返回的光束會聚或發(fā)散，進而OBJ2能在軸向不同位置形成焦點，通過這種方式即能實現(xiàn)連續(xù)的軸向掃描。對于較小的傾斜角，聚焦沒有球差。該組在實驗中表征了這種將橫向掃描轉換為軸向掃描技術的光學性能，并使用它將光片顯微鏡的成像速度提升了一個數(shù)量級，從而可以在三個維度上量化快速的囊泡動力學。該組還演示了使用雙光子光柵掃描顯微鏡以12kHz進行共振遠程聚焦，該技術可對大腦組織和斑馬魚心臟動力學進行快速成像，并具有衍射極限的分辨率。

比較兩表格中的相關參數(shù)可以看出，基于分子光學標記的成像技術已經(jīng)在生物活檢和基因表達規(guī)律方面展示了較大的優(yōu)勢。例如，正電子發(fā)射斷層成像（PET）可實現(xiàn)對分子代謝的成像，空間分辨率∶1-2mm，時間分辨率;分鐘量級。與PET比較，光學成像的應用場合更廣（可測量更多的參數(shù)，請參見表1-1），且具有更高的時間分辨率（秒級），空間分辨率可達到微米。因此，二者相比，雖然光學成像在測量深度方面不及PET，但在測量參數(shù)種類與時空分辨率方面有一定優(yōu)勢。對于小動物（如小白鼠）研究來說，光學成像技術可以實現(xiàn)小動物整體成像和在體基因表達成像。例如，初步研究表明，熒光介導層析成像可達到近10cm的測量深度;基于多光子激發(fā)的顯微成像技術可望實現(xiàn)小鼠體內基因表達的實時在體成像。國內市場多光子顯微鏡銷售渠道。

單光子激發(fā)熒光和雙光子激發(fā)熒光，是從熒光產(chǎn)生的機理上來區(qū)分的。而共焦則是熒光顯微鏡的一種結構，其目的是為了，通過共焦結構，提高整個熒光顯微鏡的空間分辨率。所以共焦熒光顯微鏡可以根據(jù)激發(fā)光源的不同，實現(xiàn)單光子共焦熒光成像或者雙光子共焦熒光成像。往往一個普通的雙光子熒光顯微鏡（沒有共焦結構）其空間分辨率也可以達到單光子共焦熒光顯微鏡的水平。這樣就可以簡化整個系統(tǒng)，相對來說，就提高了激發(fā)光源的利用率，以及熒光的探測效率，這個也是我們提倡雙光子熒光成像的原因之一。雙光子熒光共焦顯微鏡由于雙光子效應和共焦結構，分辨率則會更高，而我們通常說的共焦顯微鏡都是指單光子激發(fā)熒光的。多光子顯微鏡在生物醫(yī)學研究中有廣泛的應用，可以觀察細胞內的亞細胞結構、蛋白質分布、細胞活動等。美國在體多光子顯微鏡原理

光子顯微鏡是一種使用可見光或近紅外光的顯微鏡。美國離體多光子顯微鏡實驗操作

首代小型化雙光子顯微鏡在國際上獲得小鼠自由行為過程中大腦神經(jīng)元和突觸的動態(tài)圖像后，我們成功研制了第二代小型化雙光子顯微鏡。它具有更大的成像視野和三維成像能力，可以清晰穩(wěn)定地對自由活動小鼠三維腦區(qū)的數(shù)千個神經(jīng)元進行成像，實現(xiàn)對同一批神經(jīng)元的一個月追蹤記錄。通過對微光學系統(tǒng)的重新設計系統(tǒng)的。微物鏡工作距離延長至1mm，實現(xiàn)無創(chuàng)成像。內嵌可拆卸的快速軸向掃描模塊，可采集深度180微米的3D體成像和多平面快速切換的實時成像。該掃描模塊由一個快速的電動變焦透鏡和一對中繼透鏡組成，在不同深度成像時可保持放大倍率恒定。其變焦模塊重量，研究人員可根據(jù)實驗需求自由拆卸。此外，新版微型化成像探頭可整體即時拔插，極大地簡化了實驗操作，避免了長周期實驗時對動物的干擾。在重復裝卸探頭同一批神經(jīng)元時，視場旋轉角小于，邊界偏差小于35微米。美國離體多光子顯微鏡實驗操作