新一代微型化雙光子熒光顯微鏡體積小，重只2.2克，適于佩戴在小動(dòng)物頭部顱窗上，實(shí)時(shí)記錄數(shù)十個(gè)神經(jīng)元、上千個(gè)神經(jīng)突觸的動(dòng)態(tài)信號(hào)。在大型動(dòng)物上，還可望實(shí)現(xiàn)多探頭佩戴、多顱窗不同腦區(qū)的長(zhǎng)時(shí)程觀測(cè)。相比單光子激發(fā)，雙光子激發(fā)具有良好的光學(xué)斷層、更深的生物組織穿透等優(yōu)勢(shì)，其橫向分辨率達(dá)到0.65μm，成像質(zhì)量與商品化大型臺(tái)式雙光子熒光顯微鏡可相媲美，遠(yuǎn)優(yōu)于目前領(lǐng)域內(nèi)主導(dǎo)的、美國(guó)腦科學(xué)計(jì)劃重要團(tuán)隊(duì)所研發(fā)的微型化寬場(chǎng)顯微鏡。采用雙軸對(duì)稱(chēng)高速微機(jī)電系統(tǒng)轉(zhuǎn)鏡掃描技術(shù)，成像幀頻已達(dá)40Hz（256*256像素），同時(shí)具備多區(qū)域隨機(jī)掃描和每秒1萬(wàn)線(xiàn)的線(xiàn)掃描能力。此外，采用自主設(shè)計(jì)可傳導(dǎo)920nm飛秒激光的光子晶體光纖，該系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了微型雙光子顯微鏡對(duì)腦科學(xué)領(lǐng)域較廣泛應(yīng)用的指示神經(jīng)元活動(dòng)的熒光探針（如GCaMP6）的有效利用。同時(shí)采用柔性光纖束進(jìn)行熒光信號(hào)的接收，解決了動(dòng)物的活動(dòng)和行為由于熒光傳輸光纜拖拽而受到干擾的難題。未來(lái)，與光遺傳學(xué)技術(shù)的結(jié)合，可望在結(jié)構(gòu)與功能成像的同時(shí)，精細(xì)地操控神經(jīng)元和神經(jīng)回路的活動(dòng)。雙光子顯微鏡為什么穿透能力強(qiáng)?國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野

雙光子顯微鏡是一種先進(jìn)的成像技術(shù)，能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞或組織的深層觀察。它的主要特點(diǎn)是使用雙光子激發(fā)來(lái)產(chǎn)生熒光，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的高分辨率成像。雙光子顯微鏡的工作原理是利用激光的脈沖寬度極窄的特性，將高能激光束聚焦到生物樣品中，激發(fā)出熒光。這個(gè)過(guò)程需要使用一個(gè)特殊的雙光子激發(fā)源，它能夠?qū)⒁粋€(gè)光子轉(zhuǎn)換為兩個(gè)光子，其中一個(gè)光子用于激發(fā)熒光，另一個(gè)光子則用于成像。雙光子顯微鏡具有以下優(yōu)點(diǎn)：高分辨率：由于雙光子激發(fā)的特性，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品的高分辨率成像，特別是對(duì)于深層組織的觀察。穿透深度大：雙光子激光的波長(zhǎng)較長(zhǎng)，能夠更好地穿透生物組織，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)深層細(xì)胞的觀察。熒光壽命長(zhǎng)：雙光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命比單光子激發(fā)產(chǎn)生的熒光壽命長(zhǎng)，這使得雙光子顯微鏡能夠更好地區(qū)分不同的熒光標(biāo)記物。減少光毒性：由于雙光子激發(fā)的能量較低，因此對(duì)生物樣品的損傷較小，可以減少光毒性?？傊?，雙光子顯微鏡是一種非常有用的成像技術(shù)，可以用于生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、材料科學(xué)等領(lǐng)域的研究。美國(guó)激光雙光子顯微鏡成像原理雙光子顯微鏡已延伸到各個(gè)領(lǐng)域研究中，它能對(duì)樣品進(jìn)行三維觀察。

1990年初，當(dāng)WinfriedDenk剛從康奈爾大學(xué)博士畢業(yè)準(zhǔn)備前往瑞士讀博后時(shí)，他看了一本關(guān)于激光掃描顯微鏡的書(shū)，從中了解到非線(xiàn)性光學(xué)效應(yīng)——強(qiáng)光和物質(zhì)的相互作用。當(dāng)時(shí)，Denk有同事研究生物樣品中的鈣離子但苦于沒(méi)有強(qiáng)大的紫外激光器和光學(xué)元件，于是他就想到如果使用雙光子吸收就能夠繞開(kāi)紫外，換言之，與其通過(guò)一個(gè)紫外光子激發(fā)標(biāo)記的鈣離子，通過(guò)兩個(gè)雙倍波長(zhǎng)的可見(jiàn)光光子也能激發(fā)相同的熒光。有了想法后馬上實(shí)驗(yàn)。借了一套染料飛秒激光器，Denk聯(lián)合他的導(dǎo)師WattWebb及其博士生JamesStrickler只用六個(gè)小時(shí)就完成了實(shí)驗(yàn)搭建，采集數(shù)據(jù)則用了兩到三天，于是一篇里程碑式的文章就此誕生了。

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。在深度組織中以較長(zhǎng)時(shí)間對(duì)細(xì)胞成像，雙光子顯微鏡是當(dāng)前之選。

雙光子顯微鏡是激光掃描共聚焦顯微鏡和雙光子激發(fā)技術(shù)相結(jié)合的新技術(shù)。雙光子激發(fā)的基本原理是:在光子密度較高的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)波長(zhǎng)較長(zhǎng)的光子，經(jīng)過(guò)短暫的所謂激發(fā)態(tài)壽命后，發(fā)射一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子；效果和用波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子激發(fā)熒光分子是一樣的。雙(多)光子成像的優(yōu)點(diǎn)是具有更深的組織穿透深度，紅外光可以在平面上探測(cè)到極限為1mm的組織區(qū)域；因?yàn)樾盘?hào)背景比高，所以具有更高的對(duì)比度；由于激發(fā)體積小，具有定點(diǎn)激發(fā)、光毒性小的特點(diǎn)；激發(fā)波長(zhǎng)由紫外、可見(jiàn)光調(diào)整為紅外激發(fā)，更加安全。雙光子顯微鏡使用長(zhǎng)波長(zhǎng)脈沖光，是通過(guò)物鏡匯聚的。國(guó)內(nèi)ultimainvestigator雙光子顯微鏡熒光壽命計(jì)數(shù)

對(duì)于顯微成像技術(shù)包含：寬場(chǎng)熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡、轉(zhuǎn)盤(pán)共聚焦顯微鏡、雙光子顯微鏡。國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對(duì)熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。國(guó)外激光雙光子顯微鏡成像視野