首先，雙光子成像采用波長范圍約在700~1000nm的近紅外光激發(fā)，在組織中的散射系數(shù)較小，穿透性很好，因此非常適合厚樣本的觀察。同時，由于是近紅外光激發(fā)，也能避免樣品中激發(fā)波長較短的自發(fā)熒光物質(zhì)的干擾，可獲得較強的熒光信號（如下圖）。所以雙光子成像具有較深的穿透力和較小的光毒性。通常在活物腦組織中雙光子顯微鏡有效成像深度可達(dá)200~500μm，能夠較好地進(jìn)行三維成像。雙光子成像的另一大優(yōu)勢在于精確的空間點聚焦性。一般條件下，物質(zhì)只會被單光子激發(fā)，只有在光子密度足夠高的情況下，物質(zhì)才會吸收兩個光子從而被激發(fā)，所以，雙光子只會在光子密度蕞高的物鏡焦點附近發(fā)生，很少產(chǎn)生焦平面外的雜散光（如下圖）。這種性質(zhì)既提高了成像質(zhì)量，也降低了樣本的光漂白、光損傷區(qū)域?；谶@些優(yōu)勢，使得雙光子顯微鏡非常適合對活細(xì)胞、活組織進(jìn)行長時間在體成像。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。熒光雙光子顯微鏡用途

配合雙光子激發(fā)技術(shù)，激光共聚掃描顯微鏡則能更好得發(fā)揮功效。那么，什么是雙光子激發(fā)技術(shù)呢？在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收2個長波長的光子使電子躍遷到較高能級，經(jīng)過一個很短的時間后，電子再躍遷回低能級同時放出一個波長為長波長一半的光子（P=h/λ）。利用這個原理，便誕生了雙光子激發(fā)技術(shù)。雙光子顯微鏡使用長波長脈沖激光，通過物鏡匯聚，由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，而物鏡焦點處的光子密度是比較高的，所以只有在焦點處才能發(fā)生雙光子激發(fā)，產(chǎn)生熒光，該點產(chǎn)生的熒光再穿過物鏡，被光探頭接收，從而達(dá)到逐點掃描的效果。2PPLUS雙光子顯微鏡供應(yīng)商聯(lián)系方式雙光子顯微鏡為什么穿透能力強?

臨研所、病理科和科研處邀請北京大學(xué)王愛民副教授在2020年12月22日做了題目為“新一代微型雙光子顯微成像系統(tǒng)介紹及其在臨床醫(yī)療診斷”的學(xué)術(shù)報告。學(xué)術(shù)報告由臨研所醫(yī)學(xué)實驗研究平臺潘琳老師主持。王愛民，北京大學(xué)信息科學(xué)技術(shù)學(xué)院副教授，畢業(yè)于北京大學(xué)物理系，獲學(xué)士、碩士學(xué)位，后于英國巴斯大學(xué)物理系獲博士學(xué)位。該研究組研發(fā)的微型雙光子顯微鏡，第1次在國際上獲得了小鼠大腦神經(jīng)元和神經(jīng)突觸清晰穩(wěn)定的動態(tài)信號，該成果獲得了2017年度“中國光學(xué)進(jìn)展”和“中國科學(xué)進(jìn)展”，并被NatureMethods評為2018年度“年度方法--無限制行為動物成像”。目前，該研究組正在研究新一代雙光子顯微成像技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用，為未來即時病理、離體組織檢測、術(shù)中診斷等提供新的影像手段和分析方法。

在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時吸收兩個長波長的光子，然后發(fā)射出一個波長較短的光子，其效果和使用一個波長為長波長一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時，在波長為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來的不利影響。雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長)。雖然染料激光器對于實驗室演示尚可，但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢，鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長調(diào)諧范圍，而近紅外相比可見光穿透更深，對生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺較左邊?？茖W(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實驗室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡，如果雙光子吸收可行，那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約在1.3和1.7微米，其成像深度也比雙光子更深，目前記錄約為2.2毫米，人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡，三光子還要求以較低重頻使用更強和更短的激光脈沖，而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求，但是對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。如果已經(jīng)有了飛秒光，就可以幾套雙光子顯微鏡共享一臺，只需分光即可。國外激光雙光子顯微鏡授權(quán)商

用雙光子顯微鏡看看你的皮膚有沒有重?zé)ㄐ律?。熒光雙光子顯微鏡用途

WinfriedDenk使用的第1個光源是染料飛秒激光(脈沖寬度100fs，可見光波長630nm)。染料激光雖然實驗室演示可以接受，但是使用起來不方便，所以離商業(yè)化還很遠(yuǎn)。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)光源變成了飛秒鈦寶石激光器。鈦寶石激光器除了具有固態(tài)光源的優(yōu)點外，還具有近紅外波長調(diào)諧范圍寬，而近紅外比可見光穿透更深，對生物樣品的損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置，鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺左側(cè)。從雙光子到三光子科學(xué)家們正在從雙光子顯微鏡轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年，ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk的導(dǎo)師實驗室)讀博時發(fā)明了三光子顯微鏡。如果雙光子吸收是可行的，那么三光子似乎是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長的波長，大約1.3和1.7微米，成像深度比雙光子更深。目前錄音大約2.2毫米，人的大腦皮層厚度大約4毫米。與雙光子顯微鏡相比，三光子需要使用更強、更短、重復(fù)率更低的激光脈沖，這是傳統(tǒng)的鈦寶石激光器很難滿足的，但對于摻鐿光纖飛秒光參量放大器，比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)就非常容易。熒光雙光子顯微鏡用途