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國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

來源: 發(fā)布時(shí)間:2025-07-07

WinfriedDenk較初使用的光源是染料飛秒激光器(100fs脈寬、630nm可見光波長(zhǎng))。雖然染料激光器對(duì)于實(shí)驗(yàn)室演示尚可,但是使用很不方便所以遠(yuǎn)未實(shí)現(xiàn)商用。很快雙光子顯微鏡的標(biāo)配光源就變成了飛秒鈦寶石激光器。除了固態(tài)光源優(yōu)勢(shì),鈦寶石激光器還具有較寬的近紅外波長(zhǎng)調(diào)諧范圍,而近紅外相比可見光穿透更深,對(duì)生物樣品損傷更小。下圖是Thorlabs的雙光子和三光子顯微鏡配置,鈦寶石飛秒可調(diào)諧激光器位于平臺(tái)較左邊。科學(xué)家正在從雙光子轉(zhuǎn)向三光子顯微鏡。1996年,ChrisXu在康奈爾大學(xué)(Denk同導(dǎo)師實(shí)驗(yàn)室)讀博期間發(fā)明了三光子顯微鏡,如果雙光子吸收可行,那么三光子看起來也是自然的發(fā)展方向。三光子成像使用更長(zhǎng)的波長(zhǎng),大約在1.3和1.7微米,其成像深度也比雙光子更深,目前記錄約為2.2毫米,人類大腦皮層厚約4毫米。相比雙光子顯微鏡,三光子還要求以較低重頻使用更強(qiáng)和更短的激光脈沖,而傳統(tǒng)的鈦寶石激光器難以達(dá)到這些要求,但是對(duì)于摻鐿光纖飛秒光參量放大器則非常容易,比如我們的Y-Fi光參量放大器(OPA)。雙光子顯微鏡在各領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

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基因編碼的熒光探針可用于在突觸和細(xì)胞分辨率下監(jiān)測(cè)體內(nèi)神經(jīng)元信號(hào),這是揭示動(dòng)物神經(jīng)活動(dòng)復(fù)雜機(jī)制的關(guān)鍵。雙光子顯微鏡(2PM)可以對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器進(jìn)行亞細(xì)胞分辨率的成像,從而測(cè)量不透明腦深部的活動(dòng)。成像膜的電壓變化可以直接反映神經(jīng)元的活動(dòng),但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快了。目前,電壓成像主要由寬視場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但其空間分辨率較差,且只能在淺深度成像。因此,為了以高空間分辨率成像不透明腦中膜電壓的變化,需要將成像速率提高2PM。面向模塊輸出端的子脈沖序列可視為從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成空間分離和時(shí)間延遲的聚焦陣列。然后,該模塊被集成到一個(gè)帶有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是重復(fù)頻率為1MHz的920nm激光器。FACED模塊可以產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像。虛光源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束可以沿Y軸比沿X軸更好地填充物鏡,從而在X軸上產(chǎn)生0.82m和0.35m的橫向分辨率。國內(nèi)bruker雙光子顯微鏡的成像視野雙光子顯微鏡是新型的熒光顯微鏡,其原理大致是這樣的;

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使用雙光子顯微鏡可以以亞細(xì)胞分辨率對(duì)鈣離子傳感器和谷氨酸傳感器成像,從而測(cè)量不透明大腦深處的活動(dòng);成像膜電壓變化能直接反映神經(jīng)元活動(dòng),但神經(jīng)元活動(dòng)的速度對(duì)于常規(guī)的2PM來說太快。目前電壓成像主要通過寬場(chǎng)顯微鏡實(shí)現(xiàn),但它的空間分辨率較差并且只是于淺層深度。因此要在不透明的大腦中以高空間分辨率對(duì)膜電壓變化進(jìn)行成像,需要較提高2PM的成像速率。FACED模塊輸出處的子脈沖序列可以看作從虛擬光源陣列發(fā)出的光,這些子脈沖在中繼到顯微鏡物鏡后形成了一個(gè)空間上分離且時(shí)間延遲的焦點(diǎn)陣列。然后將該模塊并入具有高速數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)的標(biāo)準(zhǔn)雙光子熒光顯微鏡中,如圖2所示。光源是具有1MHz重復(fù)頻率的920nm的激光器,通過FACED模塊可產(chǎn)生80個(gè)脈沖焦點(diǎn),其脈沖時(shí)間間隔為2ns。這些焦點(diǎn)是虛擬源的圖像,虛擬源越遠(yuǎn),物鏡處的光束尺寸越大,焦點(diǎn)越小。光束沿y軸比x軸能更好地充滿物鏡,從而導(dǎo)致x軸的橫向分辨率為0.82μm,y軸的橫向分辨率為0.35μm。

TOPTICAFemtoFiberultra920超快光纖激光器是一種易于操作且無需維護(hù)的激光系統(tǒng)。其輸出波長(zhǎng)為920nm,非常適合常規(guī)熒光基團(tuán)(如GFP,eGFP,Eosin,GCaMP,CFP,Calcein或者Venus)的雙光子激發(fā)。能給熒光基團(tuán)提供比較高的峰值功率,常用于神經(jīng)科學(xué)和其他與激光有關(guān)的生物光子學(xué)學(xué)科。而且其獨(dú)特設(shè)計(jì)(制造簡(jiǎn)單且經(jīng)濟(jì)高效的光源)對(duì)雙光子熒光顯微鏡發(fā)展的革新具有潛在的可能。在雙光子顯微鏡中,峰值功率就是亮度!如果您希望獲得比較好的圖像亮度,那么你就需要短脈沖,高功率,較重要的是需要干凈的時(shí)間脈沖形狀。FemtoFiberultra920具有足夠高的輸出功率,較短的脈沖和獨(dú)特的Clean-Pulse技術(shù),以及具有相對(duì)比較高的峰值功率,使得其在雙光子顯微鏡中可以實(shí)現(xiàn)****的亮度,而不會(huì)對(duì)樣品造成不必要的加熱。FemtoFiberultra920交鑰匙,完全集成的色散補(bǔ)償(可確保樣品處的脈沖較短),內(nèi)置的功率控制,操作直觀以及其堅(jiān)固而緊湊的設(shè)計(jì),使該系統(tǒng)具有極為友好的用戶體驗(yàn),是非線性顯微鏡應(yīng)用的較好解決方案。例如熒光蛋白的雙光子激發(fā)和基于SHG的對(duì)比機(jī)制。雙光子顯微鏡觀察到的現(xiàn)象證明了鈣離子的增加依賴于肌體觸發(fā)的鈉離子作用電勢(shì)。

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要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問題,我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本“透明度”提高。高光子密度帶來的高能量容易損傷細(xì)胞,所以雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量,其脈沖達(dá)到最大值所持續(xù)的周期只有十萬億分之一秒,而其頻率可以達(dá)到80至100兆赫,這樣即能達(dá)到雙光子激發(fā)的高光子密度要求,又能不損傷細(xì)胞,使掃描能更好地進(jìn)行。雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖器。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡廠家

雙光子顯微鏡是結(jié)合了雙光子技術(shù)和掃描共聚顯微鏡的一種新型熒光顯微鏡。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

隨著技術(shù)的發(fā)展,雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化,結(jié)合它的特點(diǎn),大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面,大致可從兩個(gè)方面入手,裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化,我們可以把激光束變得更細(xì),使能量更加集中,就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本,其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射,解決這個(gè)問題,我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡,使其中的物質(zhì)(主要是脂質(zhì))被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解,讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。國內(nèi)ultima2PPLUS雙光子顯微鏡成像視野一般是多少

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