甲基化分析：DNA甲基化是哺乳動物DNA的一種常見表觀遺傳修飾，它通過調(diào)節(jié)細(xì)胞中的基因表達(dá)從而在發(fā)育和疾病過程中發(fā)揮了重要的作用。異常的DNA甲基化涉及整個基因組的整體低甲基化和位于基因啟動子區(qū)域和基因間DNA的CpG島的局部超甲基化，這是人類惡性**中一個常見的表觀遺傳改變。基于PCR的方法已經(jīng)被***的應(yīng)用于DNA甲基化的評估，其原理是先采用亞硫酸氫鹽來處理DNA，這會通過脫氨基作用將未甲基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)換為尿嘧啶，然后設(shè)計與這些DNA進(jìn)行特異結(jié)合的引物和探針進(jìn)行擴增檢測。然而，傳統(tǒng)的PCR檢測容易受到PCR抑制劑的影響，在非甲基化等位基因的背景下進(jìn)行稀有甲基化等位基因檢測的敏感性有限。而數(shù)字PCR是在無數(shù)個**的分隔之中進(jìn)行反應(yīng)，因此彼此之間較少受到抑制劑的影響，能夠?qū)鹘y(tǒng)方法檢測不到的罕見甲基化等位基因進(jìn)行精細(xì)的檢測，未來有望將DNA甲基化作為一個具有區(qū)域性*變的預(yù)測指標(biāo)或者**風(fēng)險生物標(biāo)志物來使用?；趩畏肿涌焖貾CR擴增，進(jìn)行核酸拷貝數(shù)定量的一種方法。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)

*****的實時監(jiān)控：已有數(shù)篇文章報道了使用數(shù)字PCR技術(shù)對患者***過程中的循環(huán)**DNA（ctDNA）進(jìn)行檢測，實時監(jiān)控疾病進(jìn)展。在非小細(xì)胞肺*、乳腺*和腸*等多種**患者中都取得了令人鼓舞的結(jié)果。與影像學(xué)及其他常規(guī)指標(biāo)相比，ctDNA突變及豐度改變通常會提前數(shù)月出現(xiàn)，這樣就可以提醒醫(yī)生及時調(diào)整***方案，使患者得到更有效的***。無創(chuàng)產(chǎn)前篩查：唐氏綜合征、地中海貧血或胎兒遺傳性耳聾基因檢測等，目前無創(chuàng)檢測標(biāo)本來源主要為孕婦血液，檢測胎兒DNA會受到母體DNA的干擾，依靠數(shù)字PCR可提高檢測準(zhǔn)確性。對比NGS，數(shù)字PCR技術(shù)可以提高工作效率、降低檢測成本。浙江拷貝數(shù)變異數(shù)字PCR共同合作通過鎖核酸修飾的引物增強了對互補序列的親和力和特異性，即使是微小表達(dá)差異也可以輕松檢測。

數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類似流式技術(shù)的磁珠乳液擴增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國 Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴增和流式檢測方式的BEAMing dPCR 檢測服務(wù)，但這些方法無論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。

盡管dPCR被稱作第三代PCR技術(shù)，但dPCR技術(shù)的廣泛應(yīng)用逐漸顯現(xiàn)出一些不足之處。通量不高、操作復(fù)雜，同時成本**增加，dPCR似乎還沒有找到相對qPCR足夠的不可取代性優(yōu)勢。另一方面，dPCR增加了很多技術(shù)難點，如何制作成本低廉的芯片，如何集成液滴生成和PCR擴增，如何進(jìn)行靈敏的信號檢測和分析，如何提高自動化程度，實現(xiàn)Sample-In Result-Out。相較于Digital ELISA能夠提高免疫檢測的靈敏度到fg/mL級別，實現(xiàn)了高敏蛋白的檢測，dPCR盡管發(fā)展更早，卻難以取得Killer Application，或許這也導(dǎo)致了所謂的第三代PCR在很多人看來卻沒那么“下一代”。通常CT值大于30的時候，熒光定量qPCR的精確度和重復(fù)性會**降低，這個時候可考慮數(shù)字化PCR。

20 世紀(jì)末，Vogelstein等提出數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR) 的概念，通過將一個樣本分成幾十到幾萬份，分配到不同的反應(yīng)單元，每個單元包含一個或多個拷貝的目標(biāo)分子( DNA 模板) ，在每個反應(yīng)單元中分別對目標(biāo)分子進(jìn)行PCR擴增，擴增結(jié)束后對各個反應(yīng)單元的熒光信號進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。與 qPCR 不同的是，數(shù)字PCR不依賴于CT值，因此不受擴增效率影響，擴增結(jié)束后通過直接計數(shù)或泊松分布公式來計算每個反應(yīng)單元的平均濃度(含量)，能夠?qū)⒄`差控制在5%以內(nèi)，數(shù)字PCR 可以不需要對照標(biāo)準(zhǔn)樣品和標(biāo)準(zhǔn)曲線來實現(xiàn)***定量分析。低豐度DNA模板分子的精確定量。四川PCR數(shù)字PCR活動

原始數(shù)據(jù)中往往發(fā)現(xiàn)陽性信號與陰性背景之間存在許多弱陽性信號。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)

常規(guī)PCR和實時熒光PCR定量檢測都需要已知拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)DNA制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，由于樣品測定在各種條件上不會完全一致，會造成PCR擴增效率的差異，從而影響定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。而ddPCR不受標(biāo)準(zhǔn)曲線和擴增動力學(xué)影響，可以進(jìn)行***定量。dPCR也有一些缺點，數(shù)字PCR系統(tǒng)成本高，通量有限、操作繁瑣等不足。芯片式dPCR由于芯片加工成本高，系統(tǒng)復(fù)雜度高，使得商業(yè)化優(yōu)勢不是特別明顯，特別是目前大多數(shù)分子診斷qPCR也能夠很好的滿足需求，dPCR增加的收益成本比并不算高。液滴式相對芯片式成本有所下降，但典型的液滴式dPCR液滴形成和PCR擴增和檢測都分別在不同儀器中完成，增加了很多操作，也增加了系統(tǒng)的復(fù)雜性，從這點上看全自動熒光定量PCR做的更好。PCR數(shù)字PCR專業(yè)服務(wù)