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江蘇RNA蛋白互作RIP PCR檢測(cè)

來源: 發(fā)布時(shí)間:2024-10-02

進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)時(shí),抗體的選擇是實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵之一。以下是選擇抗體時(shí)需要考慮的幾個(gè)要點(diǎn)。1. 特異性:首要考慮的是抗體的特異性。必須選擇能夠特異性識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)蛋白的抗體,以避免非特異性結(jié)合和背景噪音??梢酝ㄟ^查閱文獻(xiàn)、抗體供應(yīng)商提供的數(shù)據(jù)或進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證抗體的特異性。2. 親和力:抗體的親和力也是重要的考慮因素。高親和力的抗體能夠更緊密地結(jié)合目標(biāo)蛋白,提高免疫沉淀的效率??梢赃x擇經(jīng)過驗(yàn)證的高親和力抗體,或者通過預(yù)實(shí)驗(yàn)比較不同抗體的結(jié)合能力。3. 物種來源和反應(yīng)性:根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求選擇適當(dāng)?shù)目贵w物種來源和反應(yīng)性。確??贵w能夠與樣本中的目標(biāo)蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),同時(shí)避免與其他非目標(biāo)蛋白發(fā)生交叉反應(yīng)。4. 兼容性:考慮抗體與實(shí)驗(yàn)流程的兼容性。某些抗體可能不適用于特定的實(shí)驗(yàn)條件或步驟,因此在選擇抗體時(shí)需要仔細(xì)查閱抗體說明書和實(shí)驗(yàn)方案。綜上所述,進(jìn)行RIP實(shí)驗(yàn)時(shí),應(yīng)選擇具有高特異性、高親和力、適當(dāng)物種來源和反應(yīng)性,以及與實(shí)驗(yàn)流程兼容的抗體。通過仔細(xì)評(píng)估和選擇抗體,可以提高實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。如何設(shè)計(jì)RIP實(shí)驗(yàn),注意哪些問題。江蘇RNA蛋白互作RIP PCR檢測(cè)

RIP-Seq是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作組的高通量技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RNA測(cè)序技術(shù)對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的互作蛋白/RNA,進(jìn)行系統(tǒng)的檢測(cè)和分析。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作組數(shù)據(jù)檢測(cè),或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作組差異研究。因此,該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)前置技術(shù)。RIP-qPCR是一種檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作的靶向驗(yàn)證技術(shù)。該技術(shù)通過聯(lián)合免疫共沉淀技術(shù)和RT-qPCR檢測(cè)技術(shù),對(duì)目的蛋白在特定細(xì)胞/組織內(nèi)的蛋白/RNA互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證,明確蛋白/RNA的相互作用關(guān)系。該技術(shù)適用于目的蛋白在特定細(xì)胞/組織中的蛋白/RNA互作檢測(cè)驗(yàn)證,或用于不同遺傳背景/實(shí)驗(yàn)條件下的互作差異研究。因此,該技術(shù)是研究細(xì)胞內(nèi)蛋白/RNA互作調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的常規(guī)檢測(cè)技術(shù)。山東RNA蛋白相互作用RIP Sequencing檢測(cè)RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)有哪些應(yīng)用場(chǎng)景。

RIP-Seq檢測(cè)和RIP-qPCR驗(yàn)證要點(diǎn):

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì):盡量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)組別設(shè)計(jì)和生物學(xué)重復(fù)檢測(cè),提高后續(xù)驗(yàn)證的陽(yáng)性率。常規(guī)過表達(dá)單組(AbIPvsIgGIP);動(dòng)態(tài)互作組學(xué)(實(shí)驗(yàn)組vs對(duì)照組vsIgG組)。根據(jù)目的設(shè)計(jì)適當(dāng)?shù)纳飳W(xué)重復(fù)。如果后續(xù)以RIP-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行互作組標(biāo)準(zhǔn)分析,則需要3-4組生物學(xué)重復(fù);如果后續(xù)以尋找關(guān)鍵互作RNA,進(jìn)行深入的機(jī)制研究,則建議1-2次生物學(xué)重復(fù)。經(jīng)驗(yàn)顯示單次重復(fù)假陽(yáng)性率達(dá)90%。RIP-Seq強(qiáng)烈建議設(shè)置實(shí)驗(yàn)組別和生物學(xué)重復(fù)檢測(cè)。

蛋白表達(dá)和細(xì)胞量:細(xì)胞用量要不少于5e7(金標(biāo)準(zhǔn):320g離心細(xì)胞量50μl,保障項(xiàng)目用量)。本底低表達(dá)蛋白,建議使用過表達(dá)組進(jìn)行檢測(cè)。蛋白表達(dá)可根據(jù)WB結(jié)果或初步根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)判定。

抗體關(guān)鍵質(zhì)控:抗體特異性與親和效價(jià)要求高,盡量采用標(biāo)簽抗體或經(jīng)過CoIP效果驗(yàn)證的抗體??贵w質(zhì)量參差不齊(WB能檢測(cè)到預(yù)期條帶不到1/2,能檢測(cè)到良好結(jié)果的不到1/4)和存在非特異性結(jié)合(幾乎所有的抗體都存在非特異結(jié)合,部分非特異結(jié)合條帶遠(yuǎn)大于目的條帶),RIP-Seq需做WB和IP-WB質(zhì)控??贵w可參考數(shù)據(jù)庫(kù)。

互作蛋白篩選和驗(yàn)證:數(shù)據(jù)分析以信號(hào)強(qiáng)度作為強(qiáng)陽(yáng)篩選,以文獻(xiàn)查閱,功能匹配,批量RIP-qPCR驗(yàn)證,提高驗(yàn)證成功率。

RIP實(shí)驗(yàn)免疫沉淀用磁珠的制備:

將50μL的磁珠懸浮液轉(zhuǎn)移到每個(gè)管上(分組:AbvsIgG)。

每管中加入0.5mLRIP洗滌緩沖液,短暫渦旋,將管子放在磁性分離器上,去上清。

從磁鐵上取下試管。每管中加入0.5mLRIP洗滌緩沖液,短暫渦旋。

將試管放在磁性分離器上,然后棄用上清液。

從磁鐵上取出試管,并在100μL的RIP洗滌緩沖液中重新懸浮珠子。在試管中加入目標(biāo)抗體的~5μg。

在室溫下旋轉(zhuǎn)孵育30分鐘。

將試管短暫離心,放置在磁性分離器上,棄用上清液。

從磁鐵上取下試管。每管中加入0.5mLRIP洗滌緩沖液,短暫渦旋。9.將試管放在磁性分離器上,然后棄用上清液。重復(fù)清洗1次10.從磁鐵上取下試管。每管中加入0.5mLRIP洗滌緩沖液,短暫渦旋。把管子放在冰上。 要快速了解RIP實(shí)驗(yàn)技術(shù),可以從幾個(gè)方面入手。

RIP-seq和RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)都是研究RNA與蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)方法,但存在一些異同點(diǎn)。相同點(diǎn):兩者都基于RNA免疫沉淀(RIP)技術(shù),利用特定蛋白的抗體將RNA-蛋白質(zhì)復(fù)合物沉淀下來,以研究RNA與蛋白質(zhì)的相互作用。兩者都需要對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,以確保實(shí)驗(yàn)的特異性和準(zhǔn)確性。不同點(diǎn):實(shí)驗(yàn)?zāi)康模篟IP-seq主要用于篩選與目標(biāo)蛋白結(jié)合的未知RNA,繪制全基因組范圍的RNA與蛋白質(zhì)相互作用圖譜,而RIP-qPCR則用于驗(yàn)證與目標(biāo)蛋白結(jié)合的已知RNA。數(shù)據(jù)分析:RIP-seq產(chǎn)生高通量測(cè)序數(shù)據(jù),需要生物信息學(xué)分析以識(shí)別與蛋白質(zhì)結(jié)合的RNA序列;而RIP-qPCR產(chǎn)生定量PCR數(shù)據(jù),通過相對(duì)定量方法分析特定RNA與蛋白質(zhì)的結(jié)合情況。應(yīng)用范圍:RIP-seq更適合于發(fā)現(xiàn)新的RNA與蛋白質(zhì)的相互作用,并研究其在全基因組范圍內(nèi)的分布和特征;而RIP-qPCR更適用于特定RNA與蛋白質(zhì)相互作用的驗(yàn)證和定量研究??傊?,RIP-seq和RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)在研究RNA與蛋白質(zhì)的相互作用時(shí)各有優(yōu)勢(shì),研究者可根據(jù)具體需求選擇合適的方法。在進(jìn)行RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)時(shí),需要注意哪些問題以確保實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性和可靠性。新疆RNA蛋白互作檢測(cè)RIP PCR

RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)是一種研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)相互作用的重要方法,具有廣泛的應(yīng)用場(chǎng)景。江蘇RNA蛋白互作RIP PCR檢測(cè)

RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理是基于RNA免疫沉淀(RNA Immunoprecipitation, RIP)與實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR, qPCR)的結(jié)合。首先,通過RIP技術(shù),利用抗體特異性地識(shí)別并結(jié)合目標(biāo)RNA結(jié)合蛋白(RBP),將RBP與其結(jié)合的RNA一起沉淀下來。這一步驟依賴于抗體與RBP之間的特異性相互作用,確保只有與目標(biāo)RBP結(jié)合的RNA被沉淀。接下來,從沉淀的復(fù)合物中提取RNA,并通過逆轉(zhuǎn)錄將其轉(zhuǎn)化為cDNA。然后,利用qPCR技術(shù)對(duì)特定的RNA分子進(jìn)行定量檢測(cè)。在qPCR反應(yīng)中,通過熒光信號(hào)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè),可以準(zhǔn)確測(cè)量PCR產(chǎn)物的累積量,從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)RNA的定量分析。綜上所述,RIP-qPCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)的原理是通過特異性抗體沉淀目標(biāo)RBP及其結(jié)合的RNA,然后利用qPCR對(duì)沉淀下來的RNA進(jìn)行定量檢測(cè)。這項(xiàng)技術(shù)結(jié)合了RIP的特異性和qPCR的靈敏性,為研究細(xì)胞內(nèi)RNA與蛋白質(zhì)的相互作用提供了有力工具。通過這種方法,可以深入了解RNA與蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的結(jié)合情況,揭示轉(zhuǎn)錄后調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的動(dòng)態(tài)過程。江蘇RNA蛋白互作RIP PCR檢測(cè)

標(biāo)簽: RIP ChIP CoIP 蛋白組芯片
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