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上海實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)

來源: 發(fā)布時間:2021-12-19

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的特點(diǎn):靈敏度高:PCR產(chǎn)物的生成量是以指數(shù)方式增加的,能將皮克(pg=10-12)量級的起始待測模板擴(kuò)增到微克(μg=-6)水平。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞;在病毒的檢測中,PCR的靈敏度可達(dá)3個RFU(空斑形成單位);在細(xì)菌學(xué)中很小檢出率為3個細(xì)菌。簡便、快速:PCR反應(yīng)用耐高溫的Taq DNA聚合酶,一次性地將反應(yīng)液加好后,即在DNA擴(kuò)增液和水浴鍋上進(jìn)行變性-退火-延伸反應(yīng),一般在2~4 小時完成擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增產(chǎn)物一般用電泳分析,不一定要用同位素,無放射性污染、易推廣。純度要求低:不需要分離病毒或細(xì)菌及培養(yǎng)細(xì)胞,DNA 粗制品及RNA均可作為擴(kuò)增模板??芍苯佑门R床標(biāo)本如血液、體腔液、洗嗽液、毛發(fā)、細(xì)胞、活組織等DNA擴(kuò)增檢測。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):模板的制備,PCR的模板可以是DNA,也可以是RNA。上海實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)

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聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng):定量PCR允許實(shí)時定量和檢測特定的DNA序列,因?yàn)樗诤铣蛇^程中測量濃度。有兩種方法可以同時檢測和定量。種方法是使用在DNA雙鏈之間非特異性保留的熒光染料。第二種方法涉及編碼特定序列并被熒光標(biāo)記的探針。只有在探針與其互補(bǔ)DNA雜交后,才能使用這些方法檢測DNA。一種有趣的技術(shù)組合是實(shí)時PCR和逆轉(zhuǎn)錄。這種復(fù)雜的技術(shù)被稱為RT-qPCR,允許定量少量RNA。通過這種組合技術(shù),mRNA被轉(zhuǎn)化為cDNA,并用qPCR進(jìn)一步定量。這種技術(shù)降低了聚合酶鏈反應(yīng)終點(diǎn)出錯的可能性,增加了檢測與遺傳疾病如病癥相關(guān)的基因的機(jī)會。實(shí)驗(yàn)室使用RT-qPCR來靈敏地測量基因調(diào)控。徐州血液熒光PCR原理及步驟聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DN段的分子生物學(xué)技術(shù)。

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聚合酶鏈反應(yīng)的常見問題分析與解決方法:MgCl2濃度過高??蛇m當(dāng)降低其用量。模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應(yīng)<50 ng,而基因組DNA則應(yīng)<200 ng。引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進(jìn)行梯度稀釋重復(fù)PCR反應(yīng)。循環(huán)次數(shù)過多;增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30,縮短退火時間及延伸時間,或改用二種溫度的PCR循環(huán)。退火溫度過低。電泳體系有問題:凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大;凝膠沒有凝固好;瓊脂糖質(zhì)量差。若為PCR試劑盒則可能:由于運(yùn)輸儲存不當(dāng)引起試劑盒失效;試劑盒本身質(zhì)量有問題,如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當(dāng)。降解的陳舊模板擴(kuò)增也易產(chǎn)生涂布。

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是一種體外迅速擴(kuò)增DN段的技術(shù),它能以極少量的DNA為模版,在幾小時內(nèi)復(fù)制出上百萬份的DNA拷貝。DNA的半保留復(fù)制是生物進(jìn)化和傳代的重要途徑。雙鏈DNA在多種酶的作用下可以變性解鏈成單鏈,在DNA聚合酶與啟動子的參與下,根據(jù)堿基互補(bǔ)配對原則復(fù)制成同樣的兩分子挎貝。在實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),DNA在高溫時由于兩條鏈之間的氫鍵被破壞也可以發(fā)生變性解鏈,當(dāng)溫度降低后又可以復(fù)形成為雙鏈。因此,通過溫度變化控制DNA的變性和復(fù)性,并設(shè)計(jì)引物做啟動子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的體外復(fù)制。但是,DNA聚合酶在高溫時會失活,因此,每次循環(huán)都得加入新的DNA聚合酶,不但操作煩瑣,而且價格昂貴,制約了PCR技術(shù)的應(yīng)用和發(fā)展。發(fā)現(xiàn)耐熱DNA聚合同酶--Taq酶對于PCR的應(yīng)用有里程碑的意義,該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,不需要每個循環(huán)加酶,使PCR技術(shù)變得非常簡捷、同時也降低了成本,PCR技術(shù)得以大量應(yīng)用,并逐步應(yīng)用于臨床。PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),有些很好于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚至消失。

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現(xiàn)在有些PCR因?yàn)閿U(kuò)增區(qū)很短,即使Taq酶活性不是很好也能在很短的時間內(nèi)復(fù)制完成,因此可以改為兩步法,即退火和延伸同時在60℃-65℃間進(jìn)行,以減少一次升降溫過程,提高了反應(yīng)速度。檢測:PCR反應(yīng)擴(kuò)增出了高的拷貝數(shù),下一步檢測就成了關(guān)鍵。熒光素(溴化乙錠,EB)染色凝膠電泳是很常用的檢測手段。電泳法檢測特異性是不太高的,因此引物兩聚體等非特異性的雜交體很容易引起誤判。但因?yàn)槠浜喗菀仔?,成為了主流檢測方法。近年來以熒光探針為的檢測方法,有逐漸取代電泳法的趨勢。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)中兩個引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列,尤其是避免3 ′端的互補(bǔ)重疊。南京實(shí)時熒光PCR原理及步驟

許多疾病的未知病因的測序正在通過聚合酶鏈反應(yīng)得到解決。上海實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)

聚合酶鏈反應(yīng)注意事項(xiàng):在實(shí)驗(yàn)過程中要防止RNA的降解,保持RNA的完整性。在總RNA的提取過程中,注意避免mRNA的斷裂;為了防止非特異性擴(kuò)增,必須設(shè)陰性對照;內(nèi)參的設(shè)定:主要為了用于靶RNA的定量。常用的內(nèi)參有G3PD(甘油醛-3-磷酸脫氫酶)、β-Actin(β-肌動蛋白)等。其目的在于避免RNA定量誤差、加樣誤差以及各PCR反應(yīng)體系中擴(kuò)增效率不均一各孔間的溫度差等所造成的誤差;PCR不能進(jìn)入平臺期,出現(xiàn)平臺效應(yīng)與所擴(kuò)增的目的基因的長度、序列、二級結(jié)構(gòu)以及目標(biāo)DNA起始的數(shù)量有關(guān)。故對于每一個目標(biāo)序列出現(xiàn)平臺效應(yīng)的循環(huán)數(shù),均應(yīng)通過單獨(dú)實(shí)驗(yàn)來確定;防止DNA的污染: 采用DNA酶處理RNA; 在可能的情況下,將PCR引物置于基因的不同外顯子,以消除基因和mRNA的共線性。上海實(shí)時定量PCR技術(shù)服務(wù)

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