殺滅曲線的建立：通過(guò)建立殺滅曲線（劑量反應(yīng)曲線），確定能夠殺死未轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞的較低濃度，從而篩選得到穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。建立殺滅曲線至少選擇5個(gè)濃度。1、按照20-25%的細(xì)胞密度將未轉(zhuǎn)化的細(xì)胞鋪在合適的培養(yǎng)板上，37℃，CO2過(guò)夜培養(yǎng)（需要更高密度，可增加接種量）。2、根據(jù)細(xì)胞類型，設(shè)定合適的濃度梯度。以哺乳動(dòng)物細(xì)胞為例，可設(shè)定50，100，250，500，750，1000μg/mL。3、第2天換用新鮮配制的含有相應(yīng)濃度藥物的培養(yǎng)基，每個(gè)濃度做三個(gè)平行孔。4、接下來(lái)每3-4天更換新的含藥物培養(yǎng)基。5、按照每2天進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)，來(lái)確定殺滅未轉(zhuǎn)染細(xì)胞的恰當(dāng)濃度。通常7-10天內(nèi)能夠殺死絕大多數(shù)細(xì)胞的較低濃度為篩選用的工作濃度?？蒲袑?shí)驗(yàn)中試劑取用應(yīng)注意事項(xiàng)：應(yīng)在容器的正上方垂直滴入；膠頭滴管不要接觸容器壁。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)
穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選：1、轉(zhuǎn)染48 h后，用含適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。注意：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)的殺傷效果較好。但細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低，較好將細(xì)胞稀釋至豐度低于25%。2、每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。3、篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間（取決于宿主細(xì)胞類型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果）。4、挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。5、后續(xù)更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)固體試劑的取用:取固體量較多時(shí)用大匙,較少時(shí)用小匙。
加藥時(shí)間:由于基因轉(zhuǎn)染到細(xì)胞內(nèi)之后要一段時(shí)間才能表達(dá)出蛋白質(zhì)。所以篩選不能太早；但是也不能太晚，因?yàn)檗D(zhuǎn)染了外源基因的細(xì)胞代謝負(fù)荷較大，增值較慢，時(shí)間長(zhǎng)了就會(huì)被沒(méi)有外源基因轉(zhuǎn)入的細(xì)胞所淹沒(méi)，終導(dǎo)致篩選不出陽(yáng)性克隆，一般要在轉(zhuǎn)染24小時(shí)之后才開始加G418篩選。隨著細(xì)胞的代謝G418的濃度和活性都回下降，所以每3~5天都要更換一次含有G418的篩選液。這時(shí)藥物濃度可以降至200ug/ml。培養(yǎng)液:加藥篩選約6天左右，細(xì)胞會(huì)大量死亡，孔中只剩下的細(xì)胞。這時(shí)會(huì)出現(xiàn)兩個(gè)問(wèn)題：1.死亡的細(xì)胞會(huì)裂解釋放出有害物質(zhì)，導(dǎo)致那些有neo表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞死亡，即非選擇性死亡。2.孔中細(xì)胞數(shù)目很少，細(xì)胞之間的信號(hào)會(huì)變得很弱，也會(huì)導(dǎo)致陽(yáng)性細(xì)胞的狀態(tài)不佳甚至死亡。這個(gè)時(shí)候需要一種特殊的培養(yǎng)液：假如你要轉(zhuǎn)染3T3細(xì)胞，在3T3細(xì)胞匯合度達(dá)到80%的時(shí)候，換液，培養(yǎng)過(guò)夜之后收集培養(yǎng)液，通過(guò)濾器消毒，和新鮮的培養(yǎng)液按1：1混合備用。再轉(zhuǎn)染后篩選過(guò)程中就可以應(yīng)用這種培養(yǎng)基。
Tricine加樣緩沖液(2×)使用說(shuō)明書 說(shuō)明書：①試劑應(yīng)按標(biāo)簽說(shuō)明書儲(chǔ)存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過(guò)后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。②實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。③使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時(shí)，避免使用帶金屬部分的加樣器。④加入試劑的順序，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時(shí)間一樣。⑤按說(shuō)明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。Tricine加樣緩沖液(2×)：產(chǎn)品規(guī)格：5ml。分類：電泳蛋白。儲(chǔ)存條件：—20℃,12個(gè)月。用途：又稱三羥甲基甘氨酸加樣緩沖液,Tris-tricine緩沖系統(tǒng)的PAGE電泳。注意事項(xiàng)：主要由Tris-HCl、DTT、G-250等組成。DC細(xì)胞誘導(dǎo)：胞形態(tài)，至細(xì)胞毛刺樣突起，有典型DC形態(tài)懸浮細(xì)胞。
主要試劑配制：（1）PBS：PBS粉劑每袋加ddH2O定容至1000mL，調(diào)pH7.2，高壓滅菌，4℃保存?zhèn)溆?。?）RPIM-1640培養(yǎng)基：臨用前根據(jù)需要加15%胎牛血清，較后按1%體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液(青霉素+鏈霉素)，使青霉素和鏈霉素的終濃度分別為100 U/mL和100 U/mL，置于4℃冰箱保存。（3）臺(tái)盼藍(lán)染液：稱取4g臺(tái)盼藍(lán)，于研缽中用少量雙蒸水研磨，加雙蒸水至100mL，1500rpm離心15min，吸取上層液，即為4%水溶液。用前，用1.8%氯化鈉溶液稀釋1倍，即為2%臺(tái)盼藍(lán)染液。丁胺卡那霉素給藥說(shuō)明：配制靜脈用藥時(shí)，每500mg加入氯化鈉注射液。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)
利福平溶液怎么配制：過(guò)濾滅菌后，小份分裝（1-2ml每管）后，置于－20℃保存。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)
hochest染色和DAPI染色有什么區(qū)別：1、每個(gè)染料有自己獨(dú)特的激發(fā)譜線和發(fā)射譜線.這也是以上兩個(gè)染料的主要區(qū)別. 另外Hoechest 33258 是膜透性的,因此在活細(xì)胞時(shí)候能輕松進(jìn)入;DAPI是半透性的,有選擇性的進(jìn)入.因此Hoechest 33258 一般用來(lái)染活細(xì)胞,可以長(zhǎng)驅(qū)直入;DAPI一般是染固定細(xì)胞.2、兩者都可以用紫外看，參見以下的激發(fā)發(fā)射波長(zhǎng)Hoechst 33258的較大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm，較大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm；Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后，較大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm，較大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。DAPI的較大激發(fā)波長(zhǎng)為340nm，較大發(fā)射波長(zhǎng)為488nm；DAPI和雙鏈DNA結(jié)合后，較大激發(fā)波長(zhǎng)為364nm，較大發(fā)射波長(zhǎng)為454nm。磷酸鈉緩沖液(0.5mol/L,pH6.8)