在高光子密度的情況下，熒光分子可以同時(shí)吸收兩個(gè)長(zhǎng)波長(zhǎng)的光子，然后發(fā)射出一個(gè)波長(zhǎng)較短的光子，其效果和使用一個(gè)波長(zhǎng)為長(zhǎng)波長(zhǎng)一半的光子去激發(fā)熒光分子是相同的（如下圖）。如煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH），在單光子激發(fā)時(shí)，在波長(zhǎng)為350nm光的激發(fā)下發(fā)出450nm熒光；而在雙光子激發(fā)時(shí)，可采用750nm的激發(fā)光得到450nm熒光。由于雙光子激發(fā)需要很高的光子密度，為了不損傷細(xì)胞，雙光子顯微鏡使用高能量鎖模脈沖激光器。這種激光器發(fā)出的激光具有很高的峰值能量和很低的平均能量，從而可以減少光漂白和光毒性帶來(lái)的不利影響。雙光子顯微鏡在多個(gè)領(lǐng)域研究中已有許多成功實(shí)例。國(guó)內(nèi)激光雙光子顯微鏡光毒性

從雙光子的原理和特點(diǎn)我們就可以明顯的得出雙光子的優(yōu)點(diǎn)：☆穿透能力強(qiáng)：相對(duì)于紫外光，可見(jiàn)光和近紅外光都具有更強(qiáng)的穿透能力，因而受生物組織散射的影響更小，解決對(duì)生物組織中深層物質(zhì)的層析成像研究問(wèn)題；☆高分辨率：由于雙光子吸收截面很小，只有在焦平面很小的區(qū)域內(nèi)可以激發(fā)出熒光，雙光子吸收局限于焦點(diǎn)處的體積約為波長(zhǎng)3次方的范圍內(nèi)；☆漂白區(qū)域?。河捎诩ぐl(fā)只存在于交點(diǎn)處，所以焦點(diǎn)以外的區(qū)域都不會(huì)發(fā)生光漂白現(xiàn)象；☆熒光收集率高：與共聚焦成像相比，雙光子成像不需要光學(xué)濾波器（共焦），這樣就提高了對(duì)熒光的收集率，而收集率的提高直接導(dǎo)致圖像對(duì)比度的提高。熒光雙光子顯微鏡光毒性雙光子顯微鏡的探測(cè)器,該怎么選用?

與普通顯微鏡相比，電子顯微鏡可以在更小的尺度上觀察事物，冷凍電子顯微鏡可以觀察活性生物大分子。雙光子顯微鏡有什么優(yōu)勢(shì)？它能做普通光學(xué)顯微鏡做不到的事情嗎？原來(lái)雙光子顯微鏡可以準(zhǔn)確穿透厚標(biāo)本進(jìn)行定點(diǎn)和***觀察！因?yàn)殡姶挪ǖ牟ㄩL(zhǎng)越短，粒子越強(qiáng)，散射的影響越大。雙光子顯微鏡將激發(fā)光源改為長(zhǎng)波長(zhǎng)激光，增加了激光的穿透力，同時(shí)降低了對(duì)細(xì)胞的毒性。此外，由于雙光子激發(fā)效應(yīng)只能發(fā)生在物鏡的焦點(diǎn)處，因此掃描精度極高，還可以提高激發(fā)光效率，減少掃描點(diǎn)以外的熒光物質(zhì)的消耗。

雙光子技術(shù)在醫(yī)學(xué)診斷方面有著巨大的應(yīng)用潛力。這方面沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)和體系，需要系統(tǒng)的醫(yī)學(xué)研究和龐大的醫(yī)學(xué)數(shù)據(jù)支撐。通過(guò)基于多光子成像技術(shù)研究細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生化成分、微環(huán)境、組織形態(tài)、代謝功能的影響信息，可以發(fā)現(xiàn)與細(xì)胞學(xué)、分子生物學(xué)、組織病理學(xué)、疾病的診斷和特征的關(guān)系。共同探索生理病理基礎(chǔ)和分子細(xì)胞生物學(xué)機(jī)制，篩選皮膚病、自身免疫性疾病等疑難疾病的識(shí)別、診斷和鑒別診斷依據(jù)，建立全新完整的多光子細(xì)胞診斷數(shù)據(jù)庫(kù)，明確不同疾病的多光子臨床檢測(cè)設(shè)備產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)。在討論環(huán)節(jié)，來(lái)自病理科、呼吸中心、心內(nèi)科、神經(jīng)內(nèi)科、皮膚科、研究所的多位醫(yī)生和科研人員結(jié)合各自的工作領(lǐng)域，與王愛(ài)民副教授進(jìn)行了熱烈的討論。其中，毛發(fā)中心楊頂權(quán)主任擬再次邀請(qǐng)王愛(ài)民副教授進(jìn)行學(xué)術(shù)交流。通過(guò)此次學(xué)術(shù)交流，病理學(xué)系和研究所分別與王愛(ài)民副教授課題組達(dá)成了初步合作意向。雙光子顯微鏡可以在小鼠的的任何部位進(jìn)行有生命體成像。

雙光子的來(lái)源:飛秒激光的雙光子吸收理論早在1931年就由諾貝爾獎(jiǎng)獲得者M(jìn)ariaGoeppertMayer提出，并在30年后因?yàn)榧す舛玫綄?shí)驗(yàn)驗(yàn)證，但WinfriedDenk用了近30年才發(fā)明了雙光子顯微鏡。要理解雙光子的技術(shù)挑戰(zhàn)和飛秒激光發(fā)揮的重要作用，首先要理解非線性過(guò)程。雙光子吸收相當(dāng)于和頻產(chǎn)生的非線性過(guò)程，需要極高的電場(chǎng)強(qiáng)度，電場(chǎng)取決于聚焦光斑的大小和激光脈沖寬度。聚焦光斑越小，脈沖寬度越窄，雙光子吸收效率越高。對(duì)于衍射極限顯微鏡，聚焦在樣品上的光斑大小只與物鏡NA和激光波長(zhǎng)有關(guān)，所以關(guān)鍵變量只有激光脈沖寬度?；谝陨戏治?，能夠輸出高重復(fù)率(100MHz)的超短脈沖(100fs量級(jí))的飛秒激光已經(jīng)成為雙光子顯微鏡的標(biāo)準(zhǔn)激發(fā)光源。這再次顯示了雙光子顯微鏡的優(yōu)勢(shì):雙光子吸收只能在焦平面形成，而在焦平面之外，由于光強(qiáng)較低，無(wú)法激發(fā)，所以雙光子成像更清晰。雙光子顯微鏡廠家就找滔博生物。美國(guó)雙光子顯微鏡應(yīng)用

雙光子顯微鏡還可以對(duì)一些具有雙光子特性的染料細(xì)胞進(jìn)行特定實(shí)驗(yàn)；國(guó)內(nèi)激光雙光子顯微鏡光毒性

隨著技術(shù)的發(fā)展，雙光子顯微鏡的性能得到不斷地優(yōu)化，結(jié)合它的特點(diǎn)，大致可以分成深和活兩個(gè)方面的提升。要想讓激發(fā)激光進(jìn)入更深的層面，大致可從兩個(gè)方面入手，裝置優(yōu)化與標(biāo)本改造。關(guān)于裝置優(yōu)化，我們可以把激光束變得更細(xì)，使能量更加集中，就能讓激光穿透更深。關(guān)于標(biāo)本，其中影響光傳播的主要是物質(zhì)吸收和散射，解決這個(gè)問(wèn)題，我們需要對(duì)樣本進(jìn)行透明化處理。一種方法是運(yùn)用某種物質(zhì)將標(biāo)本浸泡，使其中的物質(zhì)（主要是脂質(zhì)）被破壞或溶解。另一種方法是運(yùn)用電泳將脂質(zhì)電解，讓標(biāo)本的“透明度”得到提高。國(guó)內(nèi)激光雙光子顯微鏡光毒性