數(shù)字PCR技術(shù)的原理非常簡(jiǎn)單，然而在樣品分散（divide）的環(huán)節(jié)上卻遇到了無(wú)法突破的瓶頸。早期的dPCR嘗試使用96孔板到384孔板甚至1536孔板作為分散反應(yīng)的載體，或者采用類(lèi)似流式技術(shù)的磁珠乳液擴(kuò)增方法(BEAMing-Beads, Emulsion, Amplification, Magnetics)，2006年 Fluidigm公司推出了***臺(tái)商品化的基于芯片的商品化數(shù)字PCR系統(tǒng)。2008年德國(guó) Inostics 推出基于磁珠法乳濁液擴(kuò)增和流式檢測(cè)方式的BEAMing dPCR 檢測(cè)服務(wù)，但這些方法無(wú)論在分散程度和數(shù)據(jù)群體的體量上都無(wú)法達(dá)到更加精細(xì)的要求，時(shí)間和耗材成本嚴(yán)重限制了dPCR技術(shù)的發(fā)展。提高檢測(cè)自動(dòng)化程度，實(shí)現(xiàn)一鍵式檢測(cè)的自動(dòng)化檢測(cè)流程。廣東PCR數(shù)字PCR
ddPCR主要有Bio-rad公司開(kāi)發(fā)的QX200系統(tǒng)和Rain Drop系統(tǒng)，QX200可以將體系分割成2萬(wàn)個(gè)微滴，Rain Drop可以分割成100萬(wàn)-1 000萬(wàn)個(gè)微滴。ddPCR原理是通過(guò)將一個(gè)待分析的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行微滴化處理，利用微滴發(fā)生器制成近20 000個(gè)油包水小微滴從而對(duì)原始體系進(jìn)行分割，樣品中的核酸分子隨機(jī)分配到大量**的微滴中，每個(gè)微滴中含有一個(gè)或不含待檢核酸分子。對(duì)微滴體系進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)以后，分析每個(gè)微滴的熒光信號(hào)，進(jìn)行有或無(wú)的判斷，將判斷結(jié)果按照泊松分布的原理，通過(guò)讀取靶標(biāo)和內(nèi)參核酸的陽(yáng)性微滴個(gè)數(shù)以及比例從而得到靶分子的拷貝數(shù)及濃度。與芯片式dPCR相比，操作簡(jiǎn)單，可以實(shí)現(xiàn)高通量的檢測(cè)，也保證一定程度上的微滴檢測(cè)穩(wěn)定性。北京高精確度數(shù)字PCR經(jīng)驗(yàn)豐富良好的引物探針設(shè)計(jì)是數(shù)字PCR實(shí)驗(yàn)獲得成功的關(guān)鍵因素之一。
數(shù)字PCR通過(guò)在一定體積內(nèi)稀釋DNA分子，實(shí)現(xiàn)DNA分子計(jì)數(shù)，從而提供了高精度拷貝數(shù)的估算。數(shù)字PCR技術(shù)在突破PCR擴(kuò)增效率限制的同時(shí)，結(jié)果也有很高的重現(xiàn)性。和傳統(tǒng)PCR相比，數(shù)字PCR技術(shù)檢測(cè)遺傳稀有突變時(shí)具有更高的靈敏度，在對(duì)于低水平痕量DNA分析也有更可靠的結(jié)果。數(shù)字PCR具有高敏感度、***定量、高特異性、使用標(biāo)本用量少等特點(diǎn)，可以為臨床提供更客觀(guān)、自動(dòng)化程度更高的定量檢測(cè)結(jié)果，而且較好的克服了**組織包埋標(biāo)本DNA質(zhì)量差、標(biāo)本量有限等問(wèn)題，目前已經(jīng)被應(yīng)用于多個(gè)研究領(lǐng)域，有望成為惡性**的診斷和監(jiān)測(cè)的可靠工具。
數(shù)字PCR 的定量方法不依賴(lài)于擴(kuò)增曲線(xiàn)的循環(huán)閾值，因此不受擴(kuò)增效率的影響，也不必采用看家基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，具有很好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性，可以實(shí)現(xiàn)***定量分析。在未來(lái)十年內(nèi)，醫(yī)學(xué)保健的目標(biāo)是提供質(zhì)量高效的個(gè)性化醫(yī)療。PCR 方法會(huì)在實(shí)現(xiàn)這個(gè)目標(biāo)的過(guò)程中發(fā)揮重要作用。相比于傳統(tǒng)的PCR，數(shù)字PCR 技術(shù)有著無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)和***的應(yīng)用前景。應(yīng)用領(lǐng)域：突變/稀有變異檢測(cè)（Mutation/Rare variant detection）拷貝數(shù)變異（Copy-number variation）進(jìn)入外周循環(huán)（包括血液和糞便）的**組織核酸分析無(wú)創(chuàng)產(chǎn)前篩查轉(zhuǎn)化移植檢測(cè)藥理學(xué)（Pharmacogenetics）基因表達(dá)分析（Geneexpression analysis）-特別針對(duì)單細(xì)胞或少量細(xì)胞或者血清血漿樣品線(xiàn)粒體拷貝數(shù)分析與線(xiàn)粒體突變分析數(shù)字PCR可以驗(yàn)證二代測(cè)序(NGS)。微反應(yīng)單元體積大小一致且穩(wěn)定是泊松分布準(zhǔn)確計(jì)算的前提。
液滴數(shù)字PCR源于乳液PCR( emulsion PCR) 技術(shù)，即將DNA模板與連接引物的磁性微球以極低的濃度(比如單拷貝) 包裹于油水兩相形成的納升至皮升級(jí)液滴中進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增后的產(chǎn)物富集在磁性微球上，收集破乳后進(jìn)行測(cè)序。通過(guò)油水兩相間隔得到的以液滴為單位的 PCR 反應(yīng)體系，比微孔板和 IFC 系統(tǒng)更容易實(shí)現(xiàn)小體積和高通量，而且系統(tǒng)簡(jiǎn)單，成本低，因此成為理想的數(shù)字PCR技術(shù)平臺(tái)。Vogelstein 及其同事提出的 BEAMing 技術(shù)就是一種基于乳液PCR的數(shù)字PCR系統(tǒng)。Lu 等也采用 BEAMing 和連接酶反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì) mRNA 的定量分析。Zhou 等在 BEAMing PCR 擴(kuò)增后破乳，將連接不同產(chǎn)物的磁珠包被在聚丙烯酰胺凝膠中制成磁珠陣列進(jìn)行熒光檢測(cè)。腦癱患兒mtDNA拷貝數(shù)變化CNV檢測(cè)。上海準(zhǔn)確數(shù)字PCR怎么樣
整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程需嚴(yán)格按照標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作。廣東PCR數(shù)字PCR
肺*的EGFR突變檢測(cè)：EGFR突變目前已成為非小細(xì)胞肺*（Non-Small-Cell Lung Cancer，NSCLC）患者常規(guī)的伴隨診斷，對(duì)于EGFR酪氨酸激酶抑制劑（TKI）的使用具有重要的指導(dǎo)作用。然而，由于多數(shù)NSCLC都處于晚期，很難取到足夠的**組織完成該檢測(cè)，不方便對(duì)患者的療效和耐藥情況進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。相反，血液、胸水以及腦脊液之類(lèi)的體液標(biāo)本中會(huì)含有**來(lái)源的DNA（Circulating tumor DNA，ctDNA），它們更容易獲取，被認(rèn)為是組織標(biāo)本的有效替代品。由于體液標(biāo)本中ctDNA的含量非常低，因此對(duì)檢測(cè)方法提出了很高的要求。近年來(lái)，有研究者證實(shí)，數(shù)字PCR的檢測(cè)敏感性可以低至0.04%，EGFR突變的血漿檢測(cè)與組織學(xué)檢測(cè)能夠有很好的吻合性，相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，數(shù)字PCR可以***提高血漿中EGFR突變的檢出率。此外，利用數(shù)字PCR***定量的優(yōu)勢(shì)，可以對(duì)血漿中EGFR突變的豐度進(jìn)行動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)，這種動(dòng)態(tài)變化與患者使用TKI的療效密切相關(guān)，可以更好的指導(dǎo)患者的***。隨著越來(lái)越多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)的出現(xiàn)，NSCLC的血液EGFR突變檢測(cè)正在成為ddPCR相當(dāng)有前景的應(yīng)用方向。廣東PCR數(shù)字PCR